by INBIO
Western blotting/ immunobloting adalah proses pemindahan hasil protein dari gel hasil elektroforesis ke membran dan digunakan untuk mendeteksi protein pada sampel jaringan. Proses ini menggunakan elektroforesis gel untuk memisahkan protein asli. Adapun tujuan western blotting yaitu:
Urutan Western Blotting
Prosedur Transfer
Cara Transfer Protein Dari Gel Ke Membran
Buffer transfer dengan kekuatan ionik lemah dipakai dalam teknik western blotting bertujuan untuk mengurangi panas karena arus. Selain itu dalam teknik western blotting ini juga menggunakan metanol untuk meningkatkan pengikatan protein pada membran dan mengurangi pelebaran gel proses transfer.
Jenis Membran
Jenis membran nitroselulosa merupakan salah satu jenis membran yang sering digunakan untuk teknik western blotting. Salah satu kelebihan dari membran nitroselulosa ini yaitu mudah digunakan dan memiliki kapasitas pengikatan yang tinggi. Tetapi membran itu semula ini juga memiliki kelemahan yaitu membran mudah sobek atau rapuh.
Membran nilon digunakan untuk transfer protein hidrofobik. Membran ini memiliki suatu kelemahan yaitu kapasitas pengikatannya rendah.
Membran PVDF ini memiliki kelebihan yaitu memiliki kapasitas pengikatan yang tinggi. Tetapi membran ini memiliki kelemahan yang berupa preparasi transfer sulit.
Antibodi Untuk Imunodeteksi
Antibodi yang digunakan untuk imunodeteksi pada umumnya harus memiliki afinitas yang tinggi seperti monoklonal maupun poliklonal. Antibodi poliklonal ini memiliki kelemahan yaitu antibodi ini mengandung antibodi yang tidak spesifik sehingga dapat memungkinkan antibodi mengikat protein yang tidak diketahui pada crude protein. Pada sistem direct yang dibutuhkan hanya antibodi primer. Sedangkan pada sistem indirect membutuhkan antibodi primer dan antibodi sekunder.
Dot Blotting
Dot blotting umumnya digunakan untuk mendeteksi keberadaan sekuen spesifik DNA atau RNA dalam sampel yang tidak di elektroforesis. Selain itu juga dapat digunakan untuk memberi informasi adanya antigen bukan berat molekul serta untuk memperkirakan konsentrasi antigen.
Prinsip Kerja
Analisis Western Blotting
Analisis western blotting merupakan analisis standar dalam aplikasi biologi molekuler. Western blotting merupakan prosedur standar untuk menilai keberhasilan prosedur rekayasa genetik. Keberhasilan rekayasa genetika dapat dinilai dari kemampuan gen dalam mengekspresikan protein target. Teknik western blotting ini juga dapat menilai protein target yang terekspresi dan dapat memperkirakan berat molekulnya. Dengan demikian analisis ini dapat menjamin ketepatan karakterisasi protein target yang diinginkan.
Referensi: Fatchiyah, Arunmingtyas E. L. Widyarti, S. Rahayu, S. 2011. Biologi Molekular Prinsip Dasar Analisis. Jakarta: Erlangga.
Sumber gambar: https://www.cusabio.com/m-244.html
AUTHOR
© Generasi Peneliti. All Rights Reserved.