Trending

Eni Hidayati                 
222 0 0
Sains dan Teknologi March 26 5 Min Read

Western Blotting




Western blotting/  immunobloting adalah proses pemindahan hasil protein dari gel hasil elektroforesis ke membran dan digunakan untuk mendeteksi protein pada sampel jaringan. Proses ini menggunakan elektroforesis gel untuk memisahkan protein asli. Adapun tujuan western blotting yaitu:

  1. Untuk mengetahui keberadaan dan berat molekul protein sampel dalam suatu campuran.
  2. Untuk membandingkan reaksi silang antar protein.
  3. Untuk mempelajari modifikasi protein selama sintesis.

Urutan Western Blotting

  1. Transfer protein dari gel ke membran.
  2. Deteksi menggunakan antibodi (inkubasi dengan antibodi primer).
  3. Inkubasi dengan antibodi sekunder berlabel enzim.
  4. Deteksi menggunakan substrat kromogenik.

Prosedur Transfer

  1. Preparasi sampel (sebagai antigen).
  2. Pemisahan protein pada gel elektroforesis.
  3. Transfer protein dari gel elektroforesis ke membran PVDF atau NC.
  4. Memblokade lokasi ikatan non-spesifik pada membran.
  5. Penambahan antibodi primer dan antibodi sekunder.
  6. Deteksi atau visualisasi pengikatan antigen-antigen.

Cara Transfer Protein Dari Gel Ke Membran

  1. Difusi sederhana.
  2. Vacuum-assisted solvent flow.
  3. Electrophoretic elution. Cara transfer protein dari gel ke membran menggunakan electrophoretic elution dapat dilakukan melalui dua metode yaitu wet transfer maupun semi-dry transfer.

Buffer transfer dengan kekuatan ionik lemah dipakai dalam teknik western blotting bertujuan untuk mengurangi panas karena arus. Selain itu dalam teknik western blotting ini juga menggunakan metanol untuk meningkatkan pengikatan protein pada membran dan mengurangi pelebaran gel proses transfer.

Jenis Membran

  1. Membran nitroselulosa

Jenis membran nitroselulosa merupakan salah satu jenis membran yang sering digunakan untuk teknik western blotting. Salah satu kelebihan dari membran nitroselulosa ini yaitu mudah digunakan dan memiliki kapasitas pengikatan yang tinggi. Tetapi membran itu semula ini juga memiliki kelemahan yaitu membran mudah sobek atau rapuh.

  1. Membran nilon

Membran nilon digunakan untuk transfer protein hidrofobik. Membran ini memiliki suatu kelemahan yaitu kapasitas pengikatannya rendah.

  1. Membran PVDF

Membran PVDF ini memiliki kelebihan yaitu memiliki kapasitas pengikatan yang tinggi. Tetapi membran ini memiliki kelemahan yang berupa preparasi transfer sulit.

Antibodi Untuk Imunodeteksi

Antibodi yang digunakan untuk imunodeteksi pada umumnya harus memiliki afinitas yang tinggi seperti monoklonal maupun poliklonal. Antibodi poliklonal ini memiliki kelemahan yaitu antibodi ini mengandung antibodi yang tidak spesifik sehingga dapat memungkinkan antibodi mengikat protein yang tidak diketahui pada crude protein. Pada sistem direct yang dibutuhkan hanya antibodi primer. Sedangkan pada sistem indirect membutuhkan antibodi primer dan antibodi sekunder.

Dot Blotting

Dot blotting umumnya digunakan untuk mendeteksi keberadaan sekuen spesifik DNA atau RNA dalam sampel yang tidak di elektroforesis. Selain itu juga dapat digunakan untuk memberi informasi adanya antigen bukan berat molekul serta untuk memperkirakan konsentrasi antigen.

Prinsip Kerja

  1. Hibridisasi (DNA-DNA hibrid).
  2. Hibridisasi probe akan mengikat DNA target dan membentuk DNA untai ganda sehingga probe berlabel radio.
  3. Probe dapat diidentifikasi dengan mudah.

Analisis Western Blotting

Analisis western blotting merupakan analisis standar dalam aplikasi biologi molekuler. Western blotting merupakan prosedur standar untuk menilai keberhasilan prosedur rekayasa genetik. Keberhasilan rekayasa genetika dapat dinilai dari kemampuan gen dalam mengekspresikan protein target. Teknik western blotting ini juga dapat menilai protein target yang terekspresi dan dapat memperkirakan berat molekulnya. Dengan demikian analisis ini dapat menjamin ketepatan karakterisasi protein target yang diinginkan.

 

Referensi: Fatchiyah, Arunmingtyas E. L. Widyarti, S. Rahayu, S. 2011. Biologi Molekular Prinsip Dasar Analisis. Jakarta: Erlangga.

Sumber gambar: https://www.cusabio.com/m-244.html

Eni Hidayati                 
222 0 0
Bagikan ini ke sosial media anda

(0) Komentar

Berikan Komentarmu

Tentang Generasi Peneliti

Generasipeneliti.id, merupakan perusahaan resmi dibawah PT Solusi Riset Indonesia yang berfokus untuk menyebarkan berita-berita baik terkait akademik di Indonesia


Our Social Media

Hubungi Kami


Customer Service

+62 8127-5915-940
generasipeneliti@gmail.com
Flag Counter

© Generasi Peneliti. All Rights Reserved.