Anggrek adalah salah satu tanaman hias yang memiliki nilai ekonomi yang tinggi karena jenis anggrek yang sangat beragam dan berpotensi sebagai tanaman eksplor. Anggrek memiliki warna bunga yang beragam termasuk anggrek yang memiliki dua warna (Phalaenopsis bellina sp.) atau tiga warna (Phalaenopsis Chan Xen Diamond). Permintaan anggrek sebagai tanaman eksplor mengalami peningkatan setiap tahunnya karena anggrek sering digunakan dalam upacara keagamaan, hiasan dan dekorasi ruangan, ucapan selamat serta untuk ungkapan dukacita. Seiring permintaan aggrek yang meningkat tetapi tidak sebanding dengan produksi anggrek yang fluktiatif di Indonesia. Fluktuatif anggrek menunjukkan perlunya peningkatan kualitas dan kuantitas penyediaan anggrek secara berkesinambungan di Indonesia.

Salah satu upaya yang dapat dilakukan dalam meningkatkan mutu dan kuantitas anggrek yaitu penyilangan antara tetua yang memiliki karakter tertentu. Pemuliaan anggrek diupayakan dapat memperluas keragaman genetik pada bentuk dan warna yang unik, disukai konsumen, frekuensi berbunga tinggi, tahan terhadap patogen penyebab penyakit dan cekaman abiotik. Dalam mencapai keberhasilan dalam perbaikan genetik anggrek melalui persilangan yang dikendalikan oleh plant breeder maka diperlukan pengetahuan mengenai hubungan kekerabatan antar tetua anggrek yang dipilih sebagai sumber gen yang dapat diukur berdasarkan kesamaan sejumlah karakter dengan dugaan bahwa karakter anggrek yang berbeda  disebabkan oleh adanya perbedaan susunan genetik pada anggrek. Karakter pada anggrek dikendalikan oleh gen (Deb et al., 2022). Gen merupakan potongan DNA yang hasil aktivitasnya (ekspresi) dapat diamati melalui perubahan karakter morfologi yang dipengaruhi oleh kondisi lingkungan. Perubahan fisiologi dan genetik pada anggrek dapat diekspresikan dengan adanya perubahan penampilan fenotipe anggrek yang bervariasi (Hossain, 2022).

Metode analisis molekuler yang dapat digunakan untuk mengidentifikasi spesifikasi DNA dari persilangan antar tetua yaitu DNA barcoding. DNA barcoding adalah teknik identifikasi molekuler yang menggunakan sekuen DNA sebagai barcode dalam menunjukkan adanya karakteristik khas sekuen DNA anggrek (Gao et al., 2019 Yip et al., 2007). Menurut Feng et al. (2015) dan Nishida et al. (2022) terdapat beberapa sekuen DNA kloroplas (matK, rbcL, psbA-trnH, dan atpF-atpH spacer) dan internal transcribed spacer (ITS) yang dapat digunakan sebagai barcode potensial dalam identifikasi molekuler anggrek menggunakan DNA barcoding.

Penanda molekuler pada ITS secara luas telah diterapkan dalam otentikasi dan analisis filogenetik anggrek. Lokus ITS dimanfaatkan sebagai penanda molekuler karena sekuennya bersifat konservatif, universal, spesifik pada setiap spesies anggrek, dan dapat dengan mudah diamplifikasi menggunakan metode PCR yang dilakukan dalam pengurutan nukleotida (sequencing) menggunakan primer (Adit et al., 2022). Menurut Chen et al. (2010) dan Feng et al. (2015) DNA barcoding menggunakan keseluruhan lokus ITS dalam identifikasi anggrek kurang efektif dan efisien dalam proses amplifikasi PCR dan sequencing. Menurut Perwitasari (2019) penggunaan primer universal untuk DNA barcoding yang mengkode keseluruhan wilayah ITS anggrek menghasilkan panjang amplicon sebesar ± 900 bp. Ukuran tersebut diangap kurang efektif dan efisien serta menimbulkan beberapa permasalahan dalam proses sequencing.

DNA mini-barcoding menggunakan sekuen ITS mulai dikembangkan sebagai metode turunan dari DNA barcoding yang dapat mengatasi permasalahan dalam menggunakan full-length ITS barcode. Identifikasi molekuler DNA mini-barcoding menggunakan sekuen pada ITS memerlukan primer spesifik yang dirancang khusus agar dapat menghasilkan fragmen pendek. Desain primer ITS yang didesain ulang juga tetap memiliki fungsi barcode (mini-barcode) untuk mengidentifikasi spesies anggrek secara akurat dan efektif (Parthibhan dan Ramasubbu, 2022).

ITS merupakan DNA non-coding yang terletak di antara gen ribosom subunit kecil (18S rRNA) dan subunit besar (26S rRNA) dalam DNA ribosom inti (nrDNA). Lokus ITS seperti ITS1 dan ITS2 merupakan DNA non-coding yang terletak di antara DNA coding (18S rRNA, 5.8S dan 26S rRNA). Sebagian sekuen ITS dari transkrip nrDNA diduga berfungsi dalam pematangan nrRNAs. Kelebihan dari lokus ITS sebagai penanda molekuler yaitu mewarisi DNA maternal dan paternal (pewarisan biparental), bersifat universal, low functional constraint), keseragaman intragenomik dan variabilitas intergenomik (Álvarez dan Wendel, 2003). Lokus DNA ribosom inti (nrDNA) yang berbeda dapat digunakan untuk meneliti garis keturunan dengan berbagai tingkat divergensi, identifikasi spesies atau varietas, hubungan filogenetik serta konservasi dan pengelolaan sumber daya genetik pada anggrek (Campbell et al., 2005; Lau et al., 2001; Clements et al., 2002; Adams et al., 2006). Sekuen ITS dari nrDNA memiliki sifat konservatif dalam evolusinya sehingga hasil sequencing wilayah ITS pada anggrek sangat berpotensi sebagai sumber karakter DNA inti dalam rekonstruksi filogenetik antar spesies anggrek. DNA barcode ITS secara luas telah diterapkan dalam otentikasi dan analisis filogenetik anggrek. Menurut Liu et al. (2014) keragaman genetik pada sekuen ITS dapat mengidentifikasi hubungan filogenetik dari 12 spesies anggrek dengan varietas yang berbeda.

Secara umum ITS pada anggrek sulit untuk diamplifikasi dengan menggunakan primer 17SE dan 26SE dalam DNA barcoding ITS karena ukuran amplicon yang tergolong panjang (±900 bp). Sehingga dibutuhkan perancangan primer spesifik yang didesain kusus untuk anggrek. Yuan et al. (2009) dan Qin et al. (2020) berpendapat bahwa penggunaan sekuen ITS1 dan ITS2 dalam mengidentifikasi anggrek mampu menunjukkan hubungan filogenetik anggrek melalui analisis DNA ITS parsial.

Menurut Handoyo dan Rudiretna (2000) perancangan primer dapat dilakukan berdasarkan sekuen DNA target  yang telah diketahui. Data sekuen DNA dapat diperoleh melalui genbank. Perancangan primer berdasarkan hasil analisis homologi dari sekuen DNA yang memiliki hubungan kekerabatan yang dekat dengan sampel dapat dilakukan apabila sekuan DNA maupun gen yang menyandi urutan protein yang dituju belum diketahui. Menurut Shneyer (2009) desain primer ITS spesifik umumnya dirancang berdasarkan sekuen pada wilayah 18S, 5.8S dan 26S. Posisi sekuen 5.8S yang terletak di antara ITS1 dan ITS2 dapat dijadikan sebagai acuan untuk mendesain dan mengembangkan primer spesifik dalam mengidentifikasi molekuler menggunakan DNA mini barcode ITS1 dan ITS2.

Desain primer yang tepat diperlukan untuk keberhasilan amplifikasi DNA sehingga perlu memenuhi parameter standar dari karakteristik umum suatu primer yang memiliki spesifikasi dan efisiensi yang tinggi. Menurut Mitsuhashi (1996) komposisi dasar dan panjang primer merupakan karakteristik penting dalam proses amplifikasi DNA target secara spesifik karena sekuen primer yang digunakan untuk amplifikasi DNA dapat memiliki efek besar pada spesifikasi dan efisiensi reaksi. Interaksi primer-primer (self-homology dan cross-homology), kandungan G dan C, suhu leleh (Tm), GC clamp, stabilitas ujung 5’, spesifikasi ujung 3’, suhu anil dan panjang amplicon yang dihasilkan merupakan parameter pending dalam mempengaruhi desain primer PCR.

  DAFTAR PUSTAKA

Adams, P. B., J. M. Burke, dan S. D. Lawson. 2006. Systematic analysis of Dendrobium swartz section Dendrocoryne in the Australian region. Plant Systematics and Evolution. 260(1):65–80.

Adit, A., Koul, M., Kapoor, R., & Tandon, R. (2022). Topological analysis of orchid-fungal endophyte interaction shows lack of phylogenetic preference. South African Journal of Botany, 149, 339-346.

Álvarez, I. dan J. F. Wendel. 2003. Ribosomal ITS sequences and plant phylogenetic inference. Molecular Phylogenetics and Evolution. 29(3):417–434.

Campbell, C. S., W. A.Wright, M. Cox, T. F. Vining, C. S. Major, dan M. P. Arsenault. 2005. Nuclear ribosomal dna internal transcribed spacer 1 (ITS1) in picea (pinaceae): sequence divergence and structure. Molecular Phylogenetics and Evolution. 35(1):165–185.

Chen, S., H. Yao, J. Han, C. Liu, J. Song, L. Shi, Y. Zhu, X. Ma, T. Gao, X. Pang, K. Luo, Y. Li, X. Li, X. Jia, Y. Lin, dan C. Leon. 2010. Validation of the ITS2 region as a novel dna barcode for identifying medicinal plant species. Journals.Plos.Org. 5(1).

Clements, M. A., D. L. Jones, I. K. Sharma, M. E. Nightingale, M. J. Garratt, K. J. Fitzgerald, dan A. M. Mackenzie. 2002. Phylogenetic systematics of the diurideae (orchidaceae) based on the ITS and 5.8S coding region of nuclear ribosomal dna. Lindleyana. 17:135–171.

Deb, C. R., & Kamba, J. (2022). Molecular characterization and study of phylogeny of some commercially important Vandaceous orchids (Orchidaceae) based on the internal transcribed spacer (ITS). South African Journal of Botany, 146, 875-882.

Feng, S., Y. Jiang, S. Wang, M. Jiang, Z. Chen, Q. Ying, dan H. Wang. 2015.  Molecular identification of Dendrobium species (orchidaceae) based on the dna barcode ITS2 region and its application for phylogenetic study. International Journal of Molecular Sciences. 16:21975–21988.

Gao, Z., Y. Liu, X. Wang, X. Wei, dan J. Han. 2019. DNA mini-barcoding: a derived barcoding method for herbal molecular identification. Frontiers in Plant Science. 10:1–11.

Handoyo, D. dan A. Rudiretna. 2000. Prinsip umum dan pelaksanaan polymerase chain reaction (pcr). Unitas. 9(1):17–29.

Hossain, M. M. (2022). Orchid mycorrhiza: Isolation, culture, characterization and application. South African Journal of Botany, 151, 365-384.

Lau, D. T.-W., P.-C. Shaw, J. Wang, dan P. P.-H. But. 2001. Authentification of medicinal Dendrobium species by the internal transcribed spacer of ribosomal dna. Planta Med. 67:456–460.

Liu, Y. T., R. K. Chen, S. J. Lin, Y. C. Chen, S. W. Chin, F. C. Chen, dan C. Y. Lee. 2014. Analysis of sequence diversity through internal transcribed spacers and simple sequence repeats to identify Dendrobium species. Genetics and Molecular Research. 13(2):2709–2717.

Mitsuhashi, M. 1996. Technical report: part 2. basic requirements for designing optimal pcr primers. Journal of Clinical Laboratory Analysis. 10(5):285–293.

Nishida, R., Howcroft, N. H., Tan, K. H., Su, Z. H., & Ono, H. (2022). Floral synomone components of fruit fly-attracting orchids, Bulbophyllum sinapis and B. hahlianum, in Papua New Guinea. Biochemical Systematics and Ecology, 105, 104481.

Parthibhan, S., & Ramasubbu, R. (2020). Mycorrhizal and endophytic fungal association in Paphiopedilum druryi (Bedd.) stein-a strict endemic and critically endangered orchid of the Western Ghats. Ecological Genetics and Genomics, 16, 100059.

Perwitasari, D. A. G. 2019. Identifikasi Anggrek Obat Dendrobium Discolor Lindl. Menggunakan DNA Barcoding. Universitas Jember.

Qin, J., Zhang, W., Zhang, S. B., & Wang, J. H. (2020). Similar mycorrhizal fungal communities associated with epiphytic and lithophytic orchids of Coelogyne corymbosa. Plant Diversity, 42(5), 362-369.

Shneyer, V. S. 2009. DNA Barcoding Is a New Approach in Comparative Genomics of Plants. Russian Journal of Genetics. November 12, 2009.

Yip, P., C. Chau, C. Mak, dan H. Kwan. 2007. DNA methods for identification of chinese medicinal materials. Chinese Medicine. 2(1):9.

Yuan, Z. Q., J. Y. Zhang, dan T. Liu. 2009. Phylogenetic relationship of china Dendrobium species based on the sequence of the internal transcribed spacer of ribosomal dna. Biologia Plantarum. 53(1):155–158.

Editor:     Rezekinta Syahputra Sembiring